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技術支持

致力于引進國外先進技術,為廣大科研工作者和醫療機構提供高質量 的科研技術支持 。

Q:

質粒上有兩個polyA序列,一個是BGHpA,一個是SV40pA,這兩個有什么區別?

A:

BGHpA是牛生長因子polyABGH聚腺苷酸化信號序列):可以有效終止轉錄和mRNA聚腺苷酸化的牛生長因子(BGH)聚腺苷酸化信號序列,多聚腺苷酸尾(或聚A尾)保護mRNA,免受核酸外切酶攻擊,并且對轉錄終結、將mRNA從細胞核輸出及進行翻譯。
SV40pA是猴空泡病毒polyASV40早期poly-A信號序列)以及SV40晚期poly (A)序列。SV40 PolyA(猴空泡病毒PolyA,簡稱PolyA)序列是有轉錄終止作用和使轉錄的mRNA添加PolyA尾的DNA序列(240 bp),含有AATAAA六核苷酸多腺苷化信


Q:

我想用真核細胞表達我的基因片段,假如我的基因片段插在多克隆位點上,但是多克隆位點與真核啟動子之間隔了一個原核的T7啟動子,就是我的目的基因與啟動子之間隔了一個原核的啟動子,這樣我的基因還能表達嗎?

A:

某些真核表達載體上同時存在CMV啟動子和T7啟動子

例如:在pcDNA3.1/myc-His系列載體中CMV啟動子位于209~863,而T7啟動子則位于863~882,這樣目的基因就可以在含有T7 RNA 聚合酶基因的宿主菌表達。在宿主細菌細胞或體外轉錄中,質粒DNA可以利用T7啟動子驅動基因表達,而在哺乳動物細胞中,轉基因表達由CMV啟動子驅動。而T7 啟動子在這個商業化載體pCDNA3.1(+)中常被用于測序。所以,若是使用真核載體pCDNA3.1(+)或者pCDNA3.1(-)的話,一般情況下是不會影響基因的表達。


Q:

請問你們的細菌有T7 polymerase可以直接在該細菌上表達克隆基因的嗎?

A:

具有T7 polymerase的表達菌株,本司常備有BL21(DE3)BL21(pLysS)兩種表達菌株:

   BL21(DE3):表達克隆于含有噬菌體T7啟動子的表達載體(pET系列)的非毒性基因。

   BL21(pLysS):pLysS含有表達T7溶菌酶的基因,適合表達毒性蛋白和非毒性蛋白。


Q:

密碼子優化過的基因,艾基生物是否還提供蛋白表達服務?

A:

艾基生物同時可為合成的基因提供蛋白表達及純化服務。艾基生物提供四大蛋白表達系統:原核蛋白表達系統、酵母蛋白表達系統、桿狀病毒-昆蟲細胞蛋白表達系統及哺乳動物細胞蛋白表達系統。若需要訂購蛋白表達服務,會有相關業務員跟進關于蛋白純白條件摸索以及蛋白純化等等工作以及報價。


Q:

艾基生物是否免費提供自備載體驗證服務?

A:

在艾基生物訂購質粒構建服務,可為您免費提供一個反應(正常情況下可測序驗證插入的MCS區域)的載體測序驗證服務。

若測序驗證由于您提供的樣品或樣品信息出現問題時,需要加測反應,則有您承擔加測費用。

Q:

怎樣處理特殊大小的細胞?

A:

有的細胞特別大或特別小,特別是一些原代細胞,還有的細胞成團無法計數。對于這種細胞,從預實驗開始就會有所不同。預實驗時,保持感染時細胞的匯合率達到30~40%,即使細胞沒有預定的10000 個/孔的數目,正式實驗的細胞匯合率應盡量控制在這個數量。對于成團的細胞,如胰島細胞,胚胎干細胞等,應注意細胞團的數目和大小,以便以后的實驗按比例放大。


Q:

加入病毒后,目的細胞死亡很多,為什么?

A:

Lentivirus可能對您的目的細胞有一定的毒性,請調整并降低感染的MOI值,并且在感染4 h、8 h、12 h后對細胞進行換液,用新鮮的完全培養液繼續培養觀察。


Q:

目的細胞可以被Lentivirus感染,但是GFP熒光強度很低,為什么?

A:

目的細胞中GFP熒光強度取決于病毒感染細胞的顆粒數、細胞本身的增殖狀態、細胞類型以及觀察時間等。一般來講,目的細胞感染病毒顆粒數越多,細胞本身增殖越快,GFP熒光會較強。Lentivirus屬于慢病毒,一般在增殖較快的細胞中病毒感染48~72h后,GFP基因表達才達到高峰。對于增殖較慢的細胞,GFP基因表達時間還會延長。


Q:

Lentivirus對目的細胞的感染效率很低,如何提高病毒的感染效率?

A:

一般我們通過提高MOI值來提高病毒的轉染效率,必要時可在培養液中加入Polybrene (4~10 μg/mL)來提高病毒的感染率。同時,目的細胞良好的生長狀態是獲得正常感染效率的保證。

 


Q:

全基因組de novo測序常見問題

A:

如何保證組裝結果的可靠性?

對于組裝的結果,除了保證Contig N50和Scaffold N50兩項指標外,還需要對組裝質量進行評估。如利用EST數據和RNA數據進行完整性評估,即評估組裝出來的基因的完整性;利用BAC數據檢驗是否有裝斷或裝錯的情況,以及利用保守基因評估(CEGAM評估/BUSCO評估)基因組組裝的完整性。

 

小片段和大片段的DNA樣品是否需要是一樣的?

(Survey和基因組 de novo 所用DNA是否需要一樣的?)

原則上進行 Survey 和 de novo 使用的 DNA 是來自一個個體的。如果DNA量不足以滿足整個de novo項目,則建議小片段文庫的DNA必須來自同一個體,大片段文庫使用同一群體的另一個個體。

 

若樣品提取困難,樣品量不足,有什么辦法可以解決?

若老師那邊樣品提取困難或者樣品量不足,有以下幾種策略:

1. 小片段采用一個個體,大片段庫采用同一群體的另一個個體;

 

2. 若一個個體的樣品量不足建小片段庫,可以將一個世系的樣品混樣進行提??;

3. 可以通過全基因組擴增技術,只需要少量的全基因組DNA,經過特殊的擴增過程,對擴增產物進行文庫構建。但是全基因組擴增的缺點是對于污染部分有偏好性,若污染序列較多,擴增會增加污染的比例。

 

樣品有污染對后續組裝有多大的影響?

樣品污染對后續組裝及分析都有較大的影響,會提高組裝難度,可以通過Survey分析對樣品中的污染進行初步評估,在組裝過程中將目標物種和污染序列分開。

 

怎樣評估研究物種的基因組大???

1. 網站查詢

查詢植物基因組大小的網站:http://data.kew.org/cvalues

查詢動物基因組大小的網站:http://www.genomesize.com

2. 流式細胞儀方法

流式細胞儀是目前比較常用的估計基因組大小的實驗方法??梢岳蠋熥约鹤隽魇皆u估,也可以我們幫助老師聯系相關公司去做。

3. Survey評估

Survey分析,即將測序得到的reads打斷成K-mer,通過K-mer分析,從數學的角度評估基因組的大小,雜合以及重復等信息。并進行初步組裝,從初步組裝的Contig的GC分布圖上,判斷該物種是否有污染等信息,從而為后續組裝策略的制定提供可靠的依據。

Q:

PCR產物經克隆后測序發現,引物處的堿基有錯誤,怎么辦?

A:

A15:因為引物純度不可能是100%,因此,挑選克隆時,有可能挑選了雜質引物擴增出的PCR產物的克隆。此時,請重新挑選一個克隆測序,會得到正確的結果。如果挑選2 ~ 3個克隆測序情況還沒改觀,我們會免費重新合成引物并以最快的速度送到您的手里。如進行索賠時,按國際行業慣例,索賠范圍限于制品價格范圍之內。


Q:

能否根據引物電泳后EB染色后條帶的亮度對合成的引物進行定量?

A:

A14:不能。因為EB是通過嵌入到核酸的雙螺旋間而使其著色的。合成的DNA分子為單鏈,只有通過自身回折形成局部發夾環結構或鏈間形成部分雙螺旋結構,才能被EB染色。由于不同引物的序列不同,形成雙螺旋的能力不同,因此染色能力不盡相同,也就不能根據EB染色帶的亮度來對合成的DNA進行定量。


Q:

合成的引物進行PCR反應時無目的條帶,如何解釋?

A:

PCR反應失敗的原因很多,可以從以下幾個方面考慮:

引物和模板是否配對,同源性有多大;

引物本身是否有立體結構;

PCR反應用試劑是否能正常工作;

PCR儀是否工作正常;

PCR反應條件是否合適;

如果一切正常,還無法解決問題時,我們可以免費重新合成引物。


Q:

使用3%Agarose凝膠電泳分析合成的引物,發現有很多條泳帶?

A:

引物進行電泳一定要使用變性PAGE電泳。由于引物是單鏈DNA,容易形成復雜的立體結構,因此進行Agarose電泳時,容易出現多條泳帶,更無法用Agarose電泳進行定量了。


Q:

測定了引物的OD值后發現A260/A280<1.8,引物純度合格嗎?

A:

由于核酸在260nm附近有強吸收,而蛋白質在280nm附近有強吸收,從生物體內提取核酸時,常用A260/A280比值來評價核酸純度(比值在1.82.0之間),這一判斷是基于序列中A、G、C、T所占比例大致相同時的結果。而合成的DNA/RNA則不同,序列很短 (通常在2030個堿基之間),其中A、G、C、T各種堿基所占比例很不相同,由于各種堿基的摩爾消光系數不同,因此不同堿基構成的引物的A260/A280比值也不同,例如當序列中C、T堿基的含量高時,該比值會大大低于1.8。所以不能用A260/A280的比值來判斷引物的純度。


Q:

一般合成的引物末端有磷酸基團嗎?

A:

沒有,53末端均為-OH基。如需要加磷酸基團,則需要使用修飾合成增加磷酸化。


Q:

如何檢測引物的純度?

A:

實驗室方便的作法是用PAGE方法。使用加有7M尿素的一定濃度的聚丙烯酰胺凝膠進行電泳,<12個堿基的引物用20%的膠,12-60個堿基的引物用16%的膠,>60個堿基的引物用12%的膠,取0.2OD左右的引物,用尿素飽和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到飽和,上樣前加熱變性(95oC,2mins)。加入尿素的目的一是變性,二是增加樣品比重,容易加樣。600V電壓進行電泳,一定時間后(2-3小時),剝膠,用熒光TLC板在紫外燈下檢測帶型,在主帶之下沒有雜帶,說明純度是好的(有時由于變性不充分,主帶之上可能會有條帶,乃是引物二級結構條帶)。


Q:

為何長鏈引物的合成費用比短鏈引物的要高?

A:

通常在合成長鏈引物時,試劑的加入量要比短鏈引物多很多,尤其是大于90bp以上的引物,由于成本的增加,從而導致價格也要增加。


Q:

艾基生物可以為您合成多長的序列?

A:

150堿基以下。


Q:

如何計算oligo的摩爾數?

A:

1OD值的Oligo的重量約為33 μg,而每個堿基的平均分子量一般按330道爾頓進行計算。因此, 合成oligonmol數一般按以下公式粗略地計算: nmole=(ODx33μg)/(堿基數x330)x1000=OD/堿基數x100

如果需要計算合成DNA的精確濃度,請按以下公式進行計算: nmole=(ODx1000)/[ (15.3xA#)+(7.4xC#)+(11.8xG#)+(9.3xT#) ]


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